咨询热线

13810961731

当前位置:首页  >  技术文章  >  相差显微镜的详细使用方法

相差显微镜的详细使用方法

更新时间:2011-10-03      点击次数:1531

 

相差显微镜的使用方法
(一)光源
    相差显微镜观察的光源要满足三个zui基本条件:*,为较强的光x。因为在相差显
微镜中环状光栏限制了相当数量的光能进入成像光路。位相板还要吸收掉直射光的60-90。库列照明方法是满足这一条件的zui有效措施。第二,必须吸收掉光源的热辐射线。因为相差显微镜下观察的对象中主要是生活状态下的活细胞。在光路上设置除热撼光片或吸热水层可以满足去热条件。第三,单色光光源能够保证正确调整生物标本的折射率差异.在光源前附加绿色滤光片足以解决这一条件.
    图10-26展示库列照明方法的光路。
奥林巴斯显微镜
    库列照明方法的*步,要放置标本,调好焦距。其次确定光源的位里。使用传统显微镜时.要把照明灯放置在适当的距离上,使光源会聚镜的焦面对在孔径光栏的平面上。具体操作是:在孔径光栏上放置磨砂玻片。当照明灯的位置适当时,在磨砂玻片上看到灯丝的影像。当使用内装光源的显微镜时,灯光的距离只能用会聚镜的位置加以调整。其次调整孔径光栏的孔径。为此目的,首先缩小孔径光栏,其次拔掉目镜,利用对焦望远目镜逐渐开大孔径光栏,使其边缘适与物镜口径相对应.这两步操作完成后即可使用显微镜。库列照明法的zui重要优点是照明光线充足均匀,并消除散射光的干扰。
(二)标本
    相差显微镜观察的标本基本上是未染色生物标本,或生活状态下的生物标本。观察这类标本时培养瓶壁、载玻片、盖玻片等一切插入光路的物体的厚薄要均匀,介面要平整,否则致使光路崎变,抵消标本细节的位相差即光程差。
(三)校对光栏和相板的共辘面
    前节已述及环状光栏与位相板的共扼关系。相差显徽镜的使用方法中zui关键性操作
就是使环状光栏的亮环与位相板的共扼面(暗环)相对准。绝不能相互偏离,也不能大小不一。如果校对不准确.要泄漏育射光,破坏相差效果。
    为了校对共扼面,首先作到光源照明正确,放置标本,调好物镜焦距,而后拔掉目镜,换插校正望远旧镜.将望远目镜的接目透镜筒(内层管)向外抽出。抽到能看清环状光栏的亮环和位相板的暗环为止。用固定螺旋把接目镜镜筒固定在此位置上,边观察边调准共扼面。如果看到像图10-27A所示环状光栏的亮环大于位相板的暗环,或像B所示前者小于后者时,要用聚光镜的升降来调整大小。当看到D所示二者偏移时,用环状光栏合轴调节螺旋调到光路中心一旦出现C所示的情况,即视野半边亮另半边暗时,调光源光轴.共扼面的正确调整以图10-27E为准.有时出现多层亮环、暗环、圈套圈的情景。这就考虑环状光栏是否处于聚光镜的前焦面上,光源的距离是否合适等同题.校准之后拔掉校正望远目镜,安放原来的目镜,进行观察.
(四)正确选用位相板,位相板的种类与功能已在前节中介绍。有些文献中往往用略号按指某种位相板。例如PM全文是positive medium,即暗反差(正反差)吸光率中度位相板。NH的全文是negative high,即明反差(负反差)吸光率高。DL=dark low,暗反差低吸收率,BM二bright medium,明反差中度吸收率。位相差观察时在什么样条件下应该用什么种类的位相板间题,无法作出定论。因为标本的各种细节的折射率各不相同。情况变化复杂,无法固定一些条件。但是大体上可以说标本细节与介质间反差显著时,可用低吸收率位相板,而反差小时,用高吸收率位相板.物体形体大时用低相板,而物体过小时用高相板。一般用惯明视显徽镜的观察者,使用暗反差相板会感到满意(见图10-25)。使用位相板的例子可引用水平敏知(1954)的表。
    当选择位相板时,预先侧定标本的折光率,由此可以推断其光程差.测定折光率的zui简便的方法是由贝克、泰勒创制的,这方法叫贝克线。就是在显徽镜下放大率500 X时,观察一个细胞或物体边缘.当镜筒向下移动时,细胞边缘的明亮的晕纹移向折射率低的介质。镜简上升时沿细胞膜边缘的纹向折射率高的细胞内部移动.这种关系用下表展示。
   上表只能提供标本和介质的折射率的差异。泰勒(Thaler,1930,1931)提出测定折射率的方法.这方法是:在显微镜放大500 X时,将被检标本浸于已知折射率的介质内。显徽镜镜筒提升时,贝克线移向折射率高的方向。镜筒下降时移向相反方向。折射率相等时贝克线消失。已知介质的折射率如下。